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試劑:
①F10培養(yǎng)液(如用RPMI1640,M199需加1mmol/L谷氨酰胺)pH6.5~6.8。
②小牛血清。
③Hanks平衡鹽溶液(10倍濃縮):甲液:NaCl80g,KCl4g,MgSO4·7H2O1g,MgCl2·6H2O1g,CaCl2·6H2O1.4g。將CaCl2溶于50ml三蒸水中,其它依次溶于400ml三蒸水中,兩液混合,加三蒸水至500ml,加氯仿1ml混勻,保存于4℃冰箱中。乙液:Na2HPO4·12H2O1.52g,KH2PO40.6g,葡萄糖10.0g,4g/L酚磺酞液50.0ml。依次溶于三蒸水400ml中,加三蒸水至500ml,加入氯仿1ml混勻,保存于4℃冰箱。Hanks平衡工作液:甲液1份,乙液1份,雙蒸水18份,混合后高壓滅菌,置4℃冰箱保存。使用前以50g/LNaHCO3溶液調(diào)至適當(dāng)pH。
④4g/L酚磺酞液:酚磺酞0.4g置研缽中研碎,逐滴加入0.05mol/LNaOH22ml。
直到所有顆粒幾乎完全溶解,加入三蒸水至100ml,置棕色瓶中保存。⑤2.5g/L胰蛋白酶溶液:稱取胰蛋白酶250mg,溶于100mlHanks溶液中,過濾除菌,或用無鈣、鎂離子溶液配制。⑥無鈣、鎂離子溶液:NaCl8.0g,KCl0.2g,枸櫞酸鈉1.0g,NaH2PO4·H2O0.05g,NaHCO31.0g,葡萄糖1.0g。依次溶于三蒸水中,最后加三蒸水至1000ml,過濾除菌,貯存于4℃冰箱中備用。⑦EDTA胰蛋白酶溶液:貯存液:NaCl80g,KCl4g,葡萄糖10g,NaHCO35.8g,胰蛋白酶5.0g,EDTA2.0g。依次溶于900ml三蒸水中,并加4g/L酚磺酞5ml,加三蒸水至1000ml,抽濾除菌、分裝,凍存?zhèn)溆谩9ぷ饕海喝≠A存液1ml,加無菌三蒸水9ml即可。⑧雙抗溶液。⑨秋水仙素(10μg/ml)。
操作方法
(1)取孕期16~20周羊水15~30ml,1000r/ml離心10min。
(2)棄去多余上清液,留1ml羊水和沉淀細(xì)胞,輕輕打散成細(xì)胞懸液。
(3)移入25ml方形培養(yǎng)瓶中,加pH6.5~6.8(含青霉素100U/ml,鏈霉素100μg/ml)的培養(yǎng)基3ml及小牛血清1ml,置37℃溫箱中培養(yǎng)。
(4)培養(yǎng)7~10天后可見大量成纖維樣或上皮樣細(xì)胞集落。此時(shí)可調(diào)換新鮮培養(yǎng)液。
(5)待細(xì)胞集落擴(kuò)大成片,并有許多透亮的圓形分裂細(xì)胞時(shí),即可加入秋水仙素,使最終濃度為0.1~0.3μg/ml,置37℃溫箱中再培養(yǎng)5~6h(上述過程均在無菌條件下進(jìn)行)。
收獲標(biāo)準(zhǔn):①以成纖維細(xì)胞為主要類型,成片細(xì)胞生長(zhǎng);②以10倍目鏡和20倍物鏡觀察,生長(zhǎng)的細(xì)胞克隆覆蓋1個(gè)或1個(gè)以上完整視野;③見到10個(gè)以上透亮的圓形細(xì)胞和10個(gè)以上雙圓形光亮的分裂細(xì)胞。
(6)如果細(xì)胞生長(zhǎng)不旺盛,生長(zhǎng)周期不齊或細(xì)胞老化,未達(dá)收獲標(biāo)準(zhǔn),可在原瓶繼續(xù)傳代培養(yǎng)。方法:在無菌條件下先倒去培養(yǎng)液,加入2.5g/L無菌胰蛋白酶液數(shù)滴,搖動(dòng)后倒去。再加入胰蛋白酶5~10滴,在37℃下輕輕搖動(dòng)約5min,使貼壁細(xì)胞脫落。加入含小牛血清的新鮮培養(yǎng)基4ml,在37℃靜置培養(yǎng)4~5h。再小心更換培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng),一般傳代后3~5天即可收獲。
(7)將培養(yǎng)液移至刻度離心管中,加ED-TA-胰蛋白酶液1ml于培養(yǎng)瓶?jī)?nèi),置37℃溫箱中5min,然后用彎頭吸管沖洗貼壁細(xì)胞(也可用2.5g/L胰蛋白酶溶液消化)。將脫離瓶壁的細(xì)胞倒入離心管中,與原培養(yǎng)液相混合,并用少量溫?zé)嵘睇}水沖洗培養(yǎng)瓶,洗下的細(xì)胞也一并倒入該離心管,以1000r/min離心10min。
(8)吸棄上清液,加入預(yù)溫37℃的0.075mol/LKCl低滲液3~5ml,置37℃10~15min。
(9)預(yù)固定、固定及制片均與外周血細(xì)胞染色體標(biāo)本的制備法相同。
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